TECNICA DE EXTRACCION DE ARN CON PERLAS MAGNETICAS (DYNAL^â)

Mercedes Del Pozo, Paola E. Leone, César Paz y Miño. Laboratorio de Genética Molecular y Citogenética Humana, PUCE.

El principio de esta técnica se basa en el complemento de las perlas magnéticas, que están unidas covalentemente con una secuencia de politiminas, con  el ARNm que tiene una cola de poliadeninas en uno de sus extremos, para dicha separación se utiliza una gradilla magnética MPC (Magnetic Particle Concentrator^â).

Procedimiento:

CONDICIONAMIENTO DE LAS PERLAS MAGNÉTICAS

- Resuspender las perlas oligo (dT) 25 fuertemente antes del uso.
- Transferir 50 ml de las perlas a un tubo eppendorf estéril de 1,5 ml y colocarlo en la gradilla magnética (MPC).
- Remover el sobrenadante una vez que la suspensión este clara. (no dejar por un largo período a las perlas sin buffer).
- Remover del MPC y prelavar las perlas por resuspensión en 400 ml de  buffer 2X binding buffer.
- Colocar nuevamente en el MPC.

PREPARACIÓN DE CÉLULAS LISADAS CON NÚCLEO LIBRE

- Tomar 200 ml de sangre en un  tubo eppendorf estéril de 1,5 ml
- Centrifugar la muestra durante 10 minutos   
- Retirar con cuidado las células blancas que se hayan obtenido luego de la centrifugación y colocar en otro eppendorf estéril.
- Añadir 700 ml de PBS para lavar la muestra.
- Centrifugar durante 5 minutos y repetir el proceso nuevamente.
- Se retira el sobrenadante y se añade al botón resultante 1 ml de solución de lisis.
- Colocar en hielo durante durante 5 minutos.
- Centrifugar 2 minutos.
- Retirar el sobrenadante.