TECNICA DE EXTRACCION DE ARN TOTAL

Mercedes Del Pozo, Paola E. Leone, César Paz y Miño. Laboratorio de Genética Molecular y Citogenética Humana, PUCE.

Modificación del Método de Chomczynski/Sacchi (1987) Single-step method of ARN isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-cloroform extraction. Analyt. Biochem. 162: 156-159.

Notas:

- El agua utilizada para preparar los reactivos debe ser tratada con DEPC (dietilpirocarbonato) y autoclavada. El DEPC es un compuesto que inhibe la acción de las ARNasas.

- Para tratar el agua con DEPC se añade 1 ml de DEPC en 1 litro de agua destilada y se le deja en agitación toda la noche. Al día siguiente se la lleva al autoclave fraccionándola en frascos pequeños.

- Las espátulas que se utilicen para pesar deberán  flamearse previamente.

Procedimiento:

Tomar un tubo cónico donde se encuentra la solución A (1,25 ml) y agregar:

- 250 ml de sangre periférica o de médula ósea (5 gotas) y
- 9 ml  de b-mercaptoetanol
- Agitar fuertemente durante 2 minutos
- Añadir la mezcla que se encuentra en el tubo rotulado FENOL 1 (125 ml  de acetato de sodio 2M (pH 4,5) y 1,25 ml de fenol (pH 4,5), 250 ml de cloroformo.
- Mezclar bien, pero con vórtex suave durante 5 minutos.
- Repartir 500 ml de la solución en 2 tubos eppendorf (hasta 0,5 en el tubo). Enfriar en hielo (refrigeradora) durante 15 minutos (se puede guardar la muestra en esta solución congelada  a -20°C hasta proseguir con los siguientes pasos de la extracción).
- Centrifugar 20 minutos al máximo a 4°C. Se formarán tres fases: 1) una superior llamada acuosa, donde se encuentra el ARN, 2) una intermedia llamada interfase, donde se encuentran las proteínas, y 3) una inferior orgánica, donde se encuentran los elementos que no interesa como fenol, SDS, etc.
- Transferir la fase acuosa a otro tubo, cuidando de no arrastrar material de la interfase (proteínas), y agregar 1/2 volumen de fenol FENOL 2 (250 ml) y  1/2 vol. de cloroformo CLOROFORMO 1 (250 ml).
- Centrifugar 15 minutos al máximo a 4°C.
-Transferir la fase acuosa a otro tubo estéril y agregar 1 volumen de cloroformo CLOROFORMO 2 (500ml).
- Centrifugar 15 minutos al máximo a 4°C.
- Transferir la fase acuosa a otro tubo estéril y agregar  la mezcla que se encuentra en el tubo rotulado ISO (que contiene 1 volumen -500ml- de isopropanol  + 1/10 vol de acetato de sodio 3M (pH 4,5). Se puede agregar también 2,5 vol de etanol en reemplazo del isopropanol.