preparación de las muestras. El tiocianato de guanidinio (potente agente caotrópico), lisa y solubiliza las células mientras inactiva rápidamente las ARNasas, en combinación con el 2-mercaptoetanol (potente agente reductor) y SDS (Duodecil Sulfato de Sodio), detergente que lisa a las células y al núcleo para liberar los ácidos nucléicos. Dado que las moléculas de ARN son muy pequeñas, las células lisadas deben ser mezcladas vigorosamente con este tipo de inactivadores de ARNasas.

La separación de ARN continúa con sucesivas extracciones con fenol-cloroformo, componentes efectivos para desnaturalizar proteínas. Por centrifugación, se formarán tres capas: una superior, fase acuosa, que contendrá los ácidos nucléicos, una intermedia, interfase, donde se encontrarán las proteínas desnaturalizadas y la capa inferior, orgánica, donde está el fenol, algunas proteínas ,  lípidos y demás componentes utilizados en la extracción. Se puede requerir adicionales tratamientos fenólicos para obtener una mayor pureza de ARN, se utiliza solo cloroformo para extraer remanentes de fenol que pudieran interferir en las posibles aplicaciones del ARN. Finalmente la precipitación se la hace utilizando etanol puro o isopropanol fríos en presencia de sales, la utilizada en este procedimiento es el acetato de sodio.

Para separar ARNm que contienen cola de poli (A)+ se lo puede hacer por cromatografía sobre columnas de celulosa oligo (dT) y también utilizando perlas  magnéticas que contienen oligo (dT).  Este último procedimiento es muy práctico y no se requiere mucho tiempo en hacerlo, se utilizan soluciones de lisis, soluciones de lavado y soluciones para la conservación del ARNm, mediante este procedimiento se elimina la necesidad de una previa separación de ARN total o cualquier otro paso de purificación.

Entre las aplicaciones más utilizadas se encuentra la formación de ADNc a partir de ARN total o ARN poli (A)+, mediada por la enzima reverso-transcriptasa, en este proceso se requiere un oligonucleótido complementario a la región 3' del molde de ARN para comenzar la síntesis. La amplificación del ADNc utiliza un procedimiento estándar de PCR . Una vez obtenido el ADNc, éste servirá como plantilla para una nueva amplificación utilizando un segundo oligonucleótido complementario a la hebra de ADNc, el que es específico para una región determinada.

Al utilizar perlas electromagnéticas en la extracción, no se requerirá un oligo para iniciar la síntesis de ADNc, sino que se lo hará por medio del oligo (dT) que se encuentra unido covalentemente a las perlas y que será complementario a la cola de poli A del ARN. Este ADNc servirá como plantilla para la amplificación de una región determinada, por PCR.

La aplicación de técnicas moleculares en investigación básica y clínica se ha incrementado en los últimos años, tal es el caso del ARN-PCR para la detección de enfermedades infecciosas, de algunos productos génicos anormales y por consiguiente para el diagnóstico y evaluación de diferentes enfermedades que tienen su origen en los genes.

En nuestro trabajo, este método lo hemos utilizado para la detección de enfermedad mínima residual mediante el análisis de la presencia  del  cromosoma Filadelfia, formado por la translocación entre los cromosomas 9 y 22 t(9;22), en casos de leucemia mieloide crónica o leucemia linfocítica aguda, el cual es un marcador genético que permite conocer el estado de la enfermedad y el tratamiento adecuado que debe recibir el individuo enfermo; se estudia también  con este método la implicación de la translocación entre los cromosomas 15 y 17 t(15;17) realacionada a casos con linfoma, y en general en el análisis de segmentos específicos de determinados genes para diversos propósitos.

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