| 5. Colocar las
muestras amplificadas y previamente desnaturalizadas en
el gel de poliacrilamida. PREPARACION DE GELES DE POLIACRILAMIDA Los geles de secuenciación deber ser hechos al menos 2 horas antes de su uso y se pueden mantener listos 24 horas antes de necesitarse. 1. Se deben preparar las siguientes soluciones stock: A. Solución de Acrilamida al 40% acrilamida 380g. (con alta pureza para secuenciación de ADN) N,N'- metilenebisacrilamida 20g. Agua destilada c.s.p. 600 ml. Calentar la solución a 37° C. para disolver los químicos. Ajustar el volumen a 1 litro con agua destilada. Filtrar la solución con un filtro de nitrocelulosa y almacenar en frascos oscuros a temperatura ambiente. El pH de la solución de acrilamida debe estar en 7,0 o menos. B. 5x TBE Tris base 54 g. Acido bórico 27,5 g. 0,5 M EDTA (pH 8,0) 20 ml. Agua deionizada c.s.p. 1 litro El pH del tampón debe estar en aproximadamente 8,3. La misma solución stock de 5x TBE deber ser usada para preparar tanto el gel como los tampones de corrida. C. 10% de Persulfato de Amonio (PSA) Persulfato de amonio 1g. Agua c.s.p. 10 ml. Esta solución puede ser almacenada a 4° C. por varias semanas. 2. Preparar los vidrios que van a servir de molde para la preparación del gel, los cuales deber estar bien lavados y limpios. Se recomienda el uso de etanol para eliminar los restos de grasa que puedan existir. 3. Colocar los 2 espaciadores de plástico flexible (usualmente de 0,4 mm) para formar un sello entre los vidrios y así evitar que se riegue el líquido. Se puede usar vaselina así como clips de metal adecuados para facilitar el procedimiento. 4. Colocar el peine que va a formar los pocillos en uno de los extremos del gel y observar si calza correctamente. Retirar luego el peine y sacar los restos de gel que allí se encuentren.
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