OBJETIVOS

1.- Aprender el mecanismo de la técnica SSCP para detección indirecta de mutaciones.

2.- Conocer su utilidad práctica en varios campos de la investigación biomédica.


INTRODUCCION

La conformación polimórfica de cadena simple (SSCP) es un método electroforético que permite la detección indirecta de mutaciones y polimorfismos. El principio de este método se basa en que la movilidad electroforética de una molécula en un gel es sensible al tamaño, carga y forma de la molécula. En condiciones no desnaturalizantes las cadenas simples del ADN tienen una estructura plegada determinada por sus interacciones moleculares y por lo tanto por su secuencia (Hayashi, 1991). De esta manera al desnaturalizarse la doble fibra de ADN las cadenas simples tomarán una conformación tridimensional según su secuencia nucleotídica, las cuales se observarán a medida que migren en un gel no desnaturalizante de acrilamida : bisacrilamida. En el análisis de la SSCP, una secuencia mutada es detectada como un cambio de la movilidad en el gel causado por su estructura o conformación alterada (Hayashi, 1991).

La SSCP detecta del 70% al 95% de mutaciones en los productos de PCR de 200pb y de menor tamaño. Si el amplificado es mayor se lo trata con enzimas de restricción para hacerlo más pequeño y poder obtener una mejor definición. Además, se pueden cambiar ciertas condiciones de electroforesis para detectar cambios nucleotídicos, estas pueden ser: temperatura, cantidad de glicerol o sucrosa.


MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:
Para la aplicación de la técnica se realizan los siguientes pasos:
1. Extracción de ADN de muestras normales y tumorales (mismo individuo). (Fig.1)

2. Amplificación de una secuencia determinada por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).(Fig.2)

3. Fabricación del gel de acrilamida-bisacrilamida 6% (stock 49:1).(Fig.3 y Fig.4)

4. Tomar 2,5ul del amplificado mediante PCR e igual volumen del buffer o tampón de carga utilizado (95% formamida, 20mM EDTA, 0,005% azul de bromofenol, 0,005% azul de xyleno cianol y agua). Se procede a desnaturalizar la mezcla a 94° C por 5' e inmediatamente pasar a hielo.