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Con los requerimientos de
temperatura y pH se trata de igualar las condiciones in
vivo, esto es de 36-38§ C y de 7,0-7,4
respectivamente. Si la temperatura supera los 39§
C provocará la muerte de las células cultivadas,
mientras que si es inferior a los 36§ C disminuirá el
índice de divisiones celulares, perjudicando la calidad
de la preparación. En la preparación cromosómica es
necesario emplear un inhibidor del huso mitótico,
especialmente en cultivos no sincronizados bloqueando el
paso entre metafase y anafase. Este tipo de químicos
impiden la formación de las fibras del huso a las cuales
se "ancla" el centrómero de cada uno de los
cromosomas metafásicos, para que cada cromátide sea
llevada a uno de los polos celulares. Entre estos
químicos se cuentan la Viniblastina, la Colchicina y su
análogo la Colcemida.
Se debe tener en consideración que el tiempo al que las
células están expuestas al inhibidor del huso
acromático es proporcional al índice metafásico,
pero una exposición prolongada resulta en la reducción
de la longitud de los cromosomas, de ahí que se ha
estimado el tiempo de exposición en 1,5 a 2 horas para
lograr un número adecuado de metafases con cromosomas lo
suficientemente elongados que facilite una buena
resolución al realizar el bandeo cromosómico.
Parte esencial de la preparación de cromosomas es el
tratamiento con un choque hipotónico. Una
solución hipotónica es aquella con una concentración
salina menor a la del citoplasma celular, de tal manera
que dictado por las leyes del movimiento osmótico habrá
un ingreso de H2O desde la solución
hipotónica hacia el interior de la célula. Este
fenómeno hincha las células, hemoliza la mayor parte de
los eritrocitos y complementa la acción del inhibidor
del huso mitótico ayudando a la dispersión de los
cromosomas.
La morfología cromosómica también se verá
influenciada enormemente por el proceso de fijación,
el fijador usado con más frecuencia en las preparaciones
cromosómicas es una mezcla de tres partes de alcohol
(etanol absoluto o metanol) y una parte de ácido
acético glacial conocida como fijador de Carnoy.
El fijador juega un papel muy importante en el
aplanamiento y separación de los cromosomas, y provoca,
además, la hemólisis de los glóbulos rojos remanentes
en la muestra. La exposición excesiva de las
células a la solución de Carnoy resultará en la
ruptura prematura de la membrana celular y la consecuente
pérdida del material genético.
MATERIALES
- 3 ml de sangre periférica
- gradilla
- 3 ml de medio de cultivo suplementado.
- estufa
- 100 microlitros de Colchicina (Colcemida)
- baño María
- solución hipotónica (Cl al 0,54%)
- centrífuga
- fijador de Carnoy (metanol-ácido acético 3:1)
- mechero
- solución de extensión al 40% agua-ácido
acético - placas portaobjetos
- tubos cónicos o frascos de vidrio para cultivo.
- pipetas Pasteur
- pera de goma
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