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  Práctica 5:  CULTIVO Y PREPARACION DE LINFOCITOS PARA ANALISIS CROMOSOMICO

OBJETIVOS

1.- Poner en práctica la técnica estándar para el cultivo y la preparación cromosómica.

2.- Obtener cromosomas metafásicos para su posterior análisis.


INTRODUCCION

Con excepción de muy pocos tejidos, las muestras usadas para estudios cromosómicos no presentan un número significativo de divisiones celulares que permitan el análisis sin un cultivo previo. Es así como las técnicas de cultivo se han constituido en parte integral del análisis citogenético. La sangre periférica es el tejido usado más frecuentemente en el estudio cromosómico postnatal por su facilidad de obtención y cultivo. De entre las células del tejido sanguíneo únicamente los leucocitos son de utilidad en el estudio citogenético, puesto que tanto plaquetas como eritrocitos carecen de núcleo.


En individuos saludables las formas totalmente diferenciadas de los tipos de leucocitos, en circulación periférica, normalmente no participan de una división celular activa, pero una de sus formas: los linfocitos pueden ser inducidos a dividirse por acción de una glicoproteína obtenida del fréjol Phaseolus vulgaris llamada Fitohemaglutinina (PHA).  El mecanismo exacto de inducción de la PHA aún se desconoce, pero se sabe que altera la permeabilidad de la membrana celular provocando un mayor ingreso de nutrientes y sustancias presentes en el medio. Este fenómeno estimula la síntesis de macromoléculas y en consecuencia se desencadena la división de la célula. In vitro se ha observado que la PHA, después de 24 horas de cultivo, causa un incremento en la síntesis de ARN, seguida de la síntesis de ADN y la división celular a las 48 horas.  Además, en las primeras 24 horas después de estimuladas las células con PHA, los linfocitos producen una sustancia llamada Interleukina-2 (IL-2), conocida también como un factor de crecimiento linfocitario, la que perpetúa el proceso de mitosis a manera de reacción en cadena.


Los linfocitos son las células blancas más pequeñas, con una proporción núcleo-citoplasma alta.  Existen dos tipos principales de linfocitos, las células T (timo dependientes) involucradas en el proceso de inmunidad celular y las células B (médula ósea dependientes) involucradas en la inmunidad humoral.  Los linfocitos T serán los estimulados selectivamente en su proliferación en los cultivos con PHA.


Para el cultivo de linfocitos se utilizan medios suplementados tales como: Medio 199, MEM, F-10, y especialmente RPMI 1640, con 10 ml de suero fetal bovino o de ternera, 0,5 ml de L-Glutamina (aminoácido), 1,5 ml de antibiótico - antimicótico (concentración con efecto bacteriostático), 1,5 ml de Hepes buffer (pH 7,2) y 20 ml de PHA (estimulador de la división), por cada 100 ml de medio de cultivo.

INDICE

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