|
Práctica
5: CULTIVO Y PREPARACION DE LINFOCITOS PARA
ANALISIS CROMOSOMICO OBJETIVOS
1.- Poner en práctica la técnica estándar para el
cultivo y la preparación cromosómica.
2.- Obtener cromosomas metafásicos para su posterior
análisis.
INTRODUCCION
Con excepción de muy pocos tejidos, las muestras usadas
para estudios cromosómicos no presentan un número
significativo de divisiones celulares que permitan el
análisis sin un cultivo previo. Es así como las
técnicas de cultivo se han constituido en parte integral
del análisis citogenético. La sangre periférica es el
tejido usado más frecuentemente en el estudio
cromosómico postnatal por su facilidad de obtención y
cultivo. De entre las células del tejido sanguíneo
únicamente los leucocitos son de utilidad en el estudio
citogenético, puesto que tanto plaquetas como
eritrocitos carecen de núcleo.
En individuos saludables las formas totalmente
diferenciadas de los tipos de leucocitos, en circulación
periférica, normalmente no participan de una división
celular activa, pero una de sus formas: los linfocitos
pueden ser inducidos a dividirse por acción de una
glicoproteína obtenida del fréjol Phaseolus vulgaris
llamada Fitohemaglutinina (PHA). El mecanismo
exacto de inducción de la PHA aún se desconoce, pero se
sabe que altera la permeabilidad de la membrana celular
provocando un mayor ingreso de nutrientes y sustancias
presentes en el medio. Este fenómeno estimula la
síntesis de macromoléculas y en consecuencia se
desencadena la división de la célula. In vitro
se ha observado que la PHA, después de 24 horas de
cultivo, causa un incremento en la síntesis de ARN,
seguida de la síntesis de ADN y la división celular a
las 48 horas. Además, en las primeras 24 horas
después de estimuladas las células con PHA, los
linfocitos producen una sustancia llamada Interleukina-2
(IL-2), conocida también como un factor de crecimiento
linfocitario, la que perpetúa el proceso de mitosis a
manera de reacción en cadena.
Los linfocitos son las células blancas más pequeñas,
con una proporción núcleo-citoplasma alta.
Existen dos tipos principales de linfocitos, las células
T (timo dependientes) involucradas en el proceso de
inmunidad celular y las células B (médula ósea
dependientes) involucradas en la inmunidad humoral.
Los linfocitos T serán los estimulados selectivamente en
su proliferación en los cultivos con PHA.
Para el cultivo de linfocitos se utilizan medios
suplementados tales como: Medio 199, MEM, F-10, y
especialmente RPMI 1640, con 10 ml de suero fetal bovino
o de ternera, 0,5 ml de L-Glutamina (aminoácido), 1,5 ml
de antibiótico - antimicótico (concentración con
efecto bacteriostático), 1,5 ml de Hepes buffer (pH 7,2)
y 20 ml de PHA (estimulador de la división), por cada
100 ml de medio de cultivo.
|
|