| PROCEDIMIENTO 1. Tomar 3 ml de sangre venosa en una jeringa estéril que contenga previamente una gota de anticoagulante (Heparina). 2. En condiciones de esterilidad, colocar en un tubo cónico o en un frasco de vidrio 4 ml de medio de cultivo suplementado y 9 gotas de la muestra de sangre heparinizada. 3. Poner a cultivar en una estufa a 37§ C por 72 horas. Dos horas antes de la cosecha añadir al cultivo 100 microlitros de Colchicina (Colcemida). 4. Sacar la muestra de la estufa y someterla a centrifugación por 5 minutos a 2.500 revoluciones por minuto (rpm), extraer el sobrenadante con una pipeta Pasteur debidamente rotulada dejando aproximadamente 1 ml por sobre el precipitado y resuspender. Es necesario aplastar el chupón de goma de la pipeta y eliminar el aire de su interior fuera del tubo con el que se está trabajando, pues caso contrario todo el contenido se mezclaría. 5. Introducir la muestra resuspendida en la pipeta Pasteur y agregar 6 ml de solución hipotónica precalentada a 37§ C en el tubo cónico, dejar resbalar el contenido de la pipeta por las paredes del tubo e incubarlo por 20 minutos a 37§ C en baño María. 6. Centrifugar por 5 minutos (2.500 rpm), extraer el sobrenadante y resuspender. 7. Absorber el precipitado en la pipeta Pasteur y añadir al tubo 3 ml de fijador de Carnoy, agregar al tubo cónico con fuerza el contenido de la pipeta y resuspender la mezcla 2 o 3 veces. Dejar reposar la preparación al medio ambiente por 20 minutos. Pasado este tiempo someter a centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender. 8. Añadir por tres ocasiones 3 ml de fijador y repetir el procedimiento. Con la finalidad de mejorar la preparación cromosómica se puede someter la muestra a refrigeración por 30 minutos después del cuarto fijador, previa a la centrifugación. La cantidad de sobrenadante que debe ser eliminada después de la última centrifugación debe ser menor, dejando por sobre el precipitado cerca de 2 ml de líquido. 9. Bañar la placa portaobjetos en la solución de extensión y gotear sobre ella (de 5 a 7 gotas) el residuo resuspendido a una altura de 40-50 cm; someter a calor por un par de segundos y volver a gotear una cantidad similar de muestra. Secar al ambiente la placa preparada. RESULTADOS CONCLUSIONES CUESTIONARIO 1. Cuáles son los efectos de una mala fijación?. 2. Qué otras soluciones hipotónicas se puede emplear en reemplazo de la solución de KCl al 0,54%?. 3. En cultivo de sangre periférica a qué se llama microcultivo y macrocultivo; en qué se diferencia su metodología?.
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