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  0,1%), mezcla de los 4 dNTPs 200 µM c/u, los 2 cebadores 10 pM, ADN polimerasa termoestable, 2U/µl y agua hasta completar un volumen  final de 20 µl. B: Igual que la anterior marcada simultáneamente, utilizando (a-32P) dCTP 3.000 Ci/mmol - 10 mCi/ml, esta mezcla es opcional, ya que se puede teñir con plata, lo que es más seguro y barato.

El ADN se desnaturaliza 5 minutos a 94°C y se incuba 35 ciclos de tres temperaturas: desnaturalización, hibridación y extensión según las condiciones específicas para cada uno; el ADN se somete a una extensión final de 5-8 minutos a 72°C y refrigeración a 4°C.

Se verifica el producto amplificado mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% en tampón TBE 1X junto a un marcador de peso molecular, ADN molecular-weight marker V, de Boehringer. Se deja migrar aproximadamente 1 hora a 90 V.

POLIMORFISMO EN LA CONFORMACION DE LA CADENA SENCILLA (SSCP)

  De la reacción convencional de amplificación, se toma 2,5 µl e igual volumen de buffer de carga, constituido por formamida 95%, EDTA 20 mM, azul de bromofenol 0,005%, azul de xileno cianol 0,005% y agua. El producto amplificado en la reacción marcada, se diluye 1:10; se toma 2,5 µl de ésta e igual volumen de buffer de carga.

Cada muestra se desnaturaliza a 94°C y se carga en un gel de poliacrilamida que se revela por autoradiografía (PCR marcada) o por tinción con plata, bromuro de etidio (PCR sin marcar) o quimiolumiscencia.

GEL DE POLIACRILAMIDA PARA SSCP

Con la finalidad de aumentar la sensibilidad de la técnica de SSCP para cada exón del gen a estudiar se pueden variar las condiciones de los geles, en cuanto a concentración de la mezcla de acrilamida: N,N'-metilenbisacrilamida (49:1) al 40%, y la adición o ausencia de glicerol.

La electroforesis se corre de 5 a 18 horas a 10 W a temperatura ambiente, en tampón TBE 0,5X.

 

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