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TECNICA DEL POLIMORFISMO EN LA CONFORMACION DE LA CADENA SENCILLA BASADO EN LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR-SSCP)


Paola E. Leone, Mercedes Del Pozo, César Paz y Miño. Laboratorio de Genética Molecular y Citogenética Humana, PUCE.

Existen varias técnicas basadas en la amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar mutaciones, una de las más sensible es el polimorfismo en la conformación de la cadena sencilla basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-SSCP).

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Se amplifica el ADN proveniente de las muestras problemas, aplicando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR = polymerase chain reaction)  (Mullis y cols., 1986). Se emplean cebadores de exones o intrones, según el caso, las condiciones de reacción para dos ejemplos de exones se muestran a continuación:

EXON X: F 5´-TTGCTCACAGTGTCCTTCCC-3´,
        R 5´-TCAGCCCCACCAGTTTCATC-3´

EXON Z:  F 5´-CAGTGTCTTCCGTTCTCC-3´,
                R 5´-AGCTCAGAGAGGTTTCAA-3´


EJEMPLOS DE CEBADORES PARA LA AMPLIFICACION POR PCR DE EXONES ESPECIFICOS

EXON  NUCLEOTIDOS TAMAÑO DEL        CONDICIONES 
  (pb)                          FRAGMENTO  DE LA PCR
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    X          115-240          231  94°C 30 seg
                                      62°C 30 seg
                                      72°C 1 m 30 s
    Z          601-675        123  94°C 30 seg
                                      54°C 30 seg
                                      72°C 1 m 30 s
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Nuestro laboratorio utiliza un termociclador Perkin Elmer (35 ciclos con un paso previo de desnaturalización de 94°C por 5 minutos, la temperatura de unión se especifica para cada exón, y una elongación final de 72°C por 8 minutos, enfriamiento a 25°C por 5 minutos y 4°C).

Se preparan 2 tipos de mezcla de reacción, A: ADN 100 ng, buffer de PCR 10 X (1 X es Tris-HCl 10 mM (pH 8,3),  MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM,  Triton X-100

 

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