SECUENCIACION DEL ADN Paola
E. Leone, César Paz y Miño. Laboratorio de Genética
Molecular y Citogenética Humana, PUCE.
Para conocer la secuencia del ADN de los casos de interés, determinados por el análisis de SSCP, se aplica la técnica de secuenciación (Sanger y cols., 1977); en la que se parte de ADN de doble cadena, producto de la amplificación por PCR. Existen al menos dos tipos de secuenciación de genes: la manual y la automática. Ambas descifran el código genético por sectores, en realidad por intrones o exones, dado el tamaño de los genes y las características bioquímicas de la enzima polimerizadora que se utiliza, la Taq. Para conocer la secuencia del ADN de los casos de interés, por ejemplo aquellos que portan mutaciones y que se determinan por el análisis de SSCP (Polimorfismo en la Conformación de la Cadena Sencilla), se aplica la técnica de secuenciación manual y que ha sido ya desarrollada en nuestro laboratorio desde marzo de 1998. En esta técnica se parte de ADN de doble cadena extraído de cualquier célula por métodos estándares, sea en base a proteinasa K o fenol-cloroformo; la extracción del ácido nucleico debe realizarse en un ambiente restringido, luego el exón o intrón se lo amplifica utilizando la PCR asimétrica. En el caso de la secuenciación automática este producto debe ser previamente purificado. SECUENCIACION MANUAL En el Laboratorio seguimos el protocolo de Promega (DNA Sequencing System), que es un sistema alternativo no radiactivo para el análisis enzimático de la secuencia de los ácidos nucleicos. Se preparan 4 tubos para cada uno de los nucleótidos defectivos que se utilizan (ddNTPs: A, C, G, T), en cada uno se coloca 2 ml y se añade la mezcla para la reacción: ADN 1-2 rmol, buffer de secuenciación 5X, uno de los cebadores 4-5 rmol, ADN Taq polimerasa 5U/ml, dNTPs y agua hasta completar un volumen final de 4 ml. La reacción para secuenciación en definitiva es una PCR asimétrica, por esto sólo se utiliza uno de los cebadores. Los nucleótidos defectivos tienen la función, una vez integrados en la cadena, de suspender las subsecuentes adiciones de nucleótidos por lo que a cada paso se irán formando cadenas progresivamente más grandes, que luego serán separadas por tamaño en un gel de poliacrilamida. En cada tubo se obtendrán cadenas de diferente tamaño, que al ser pasadas en el gel permitirán descifrar el código genético. El siguiente ejemplo aclara la reacción:
HUELLA ELECTROFORETICA CODIGO |