| 3) Extensión
del primer por ADN polimerasa: Los primers son extendidos
en una cadena templado de ADN de cadena simple
(previamente desnaturalizado) gracias a la enzima ADN
polimerasa en presencia de desoxinucleósidos
trifosfato (dNTPs) bajo condiciones adecuadas de
reacción, esto da como resultado la síntesis de nuevas
cadenas de ADN complementario a las cadenas
templado. Para este paso se requieren temperaturas
entre los 60 a 72° C. Luego de la extensión
se obtienen moléculas de ADN de doble cadena, sin
embargo, la síntesis de nuevas cadenas de ADN puede ser repetida volviendo a desnaturalizar el ADN por calor (desnaturalización), seguidamente promoviendo el annealing o unión de los primers mediante el enfriamiento de la mezcla para finalmente conducir a la extensión de los primers gracias a la ADN polimerasa a la temperatura adecuada para cada reacción. Cada repetición de esta síntesis de nuevas cadenas constituye un ciclo de amplificación. La reacción de amplificación contiene dos primers dispuestos de tal manera que puedan hibridizar con las cadenas opuestas de la secuencia "blanco" o secuencia a amplificarse. Debido a que el producto extendido incluye la secuencia complementaria a la del otro primer, el producto de cada reacción sirve como templado en el nuevo ciclo de PCR verificándose así una reacción bioquímica en cadena. El impacto de esta tecnología (PCR) ha sido particularmente importante en algunos campos relacionados al análisis del genoma humano, especialmente en el mapeo genético y físico de los cromosomas y análisis de la expresión génica. MATERIALES EXTRACCION DE ADN DE SANGRE PERIFERICA - Dos muestras de 15 cc de sangre periférica heparinizada -Vortex - Suero fisiológico - Baño maría a 37§ C. - Agua bidestilada - Pipeta Pasteur - Recipiente con cloro - Centrífuga multitubos - Tampón de lisis de leucocitos: - Tubos cónicos Tris (2M) - Guantes estériles NaCl (5M) - Peras de goma EDTA (0,25M) - Vaso de precipitación. Agua químicamente pura - HCl - SDS 10% - Proteinasa K - NaCl (6M) - Etanol absoluto - Etanol al 70% - Tris-EDTA (TE) 1:0.1 pH 8
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