Práctica 9: EXTRACCION DE ADN Y REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

OBJETIVOS

1.-  Aprender la técnica de extracción de ADN humano a partir de sangre periférica.

2.-  Usar el ADN extraído en la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

3.-  Conocer las aplicaciones de la PCR.

INTRODUCCION

La PCR es una reacción bioquímica in vitro catalizada por un enzima, en el cual pequeñas cantidades de un segmento específico de ADN, que se hallan entre dos regiones de ADN de secuencia conocida, son amplificadas obteniéndose una gran cantidad de ADN linear de doble cadena.  Debido a que la PCR está basada en la acción enzimática de una ADN polimerasa (la más comúnmente utilizada es la Taq ADN pol I que es una de las enzimas más extensamente caracterizada y aplicada en biología molecular), la tecnología de la PCR fue aplicada inmediatamente en varias áreas de investigación, incluyendo la tecnología del ADN recombinante, la expresión génica, medicina general, medicina forense y evolución.  Actualmente, la tecnología  de la PCR ha adquirido mayor importancia con el desarrollo de las enzimas de restricción, con el clonaje del ADN y con el Southern blotting en el avance de la biología molecular.  Los primeros experimentos de amplificación con PCR fueron realizados por el Dr. Mullis y el Dr. Fred A. Faloona, un matemático quien desarrolló el primer dispsitivo automático regulador de la temperatura en ciclos, conocido como termociclador o máquina de PCR (Mullis y Faloona, 1987).

La amplificación del ADN se obtiene por ciclos repetidos de PCR, cada uno de los cuales tiene tres estadíos de temperatura distintos:

1) Desnaturalización del templado o "plantilla" de ADN (ADN que servirá de modelo para su amplificación) que necesita de 94 a 96° C.

2) Unión o annealing de los primers (conocidos también como cebadores).  Los primers son oligonucleótidos, formados por moléculas de cadena simple de ADN que son complementarios a ambos extremos de una secuencia determinada de ADN que actúa como templado o plantilla.  Su función es servir al templado de ADN como punto de partida para la polimerización.  Este paso requiere una temperatura que varía entre los 42  a 60° C; y

 

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