TECNICA DE DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS POR REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Angel G. Guevara, Wilson Paredes, Verónica P. Villegas. Laboratorio de Investigaciones Clínicas, Servicios Comunitarios, Hospital Vozandes - Quito.

EXTRACCION DE ADN

METODO I
Se colectan 5 ml de sangre total que se mezclan inmediatamente con 5 ml de una solución de Guanidina HCl-EDTA (6 M, 0,2M respectivamente), esta mezcla se puede guardar a temperatura ambiente hasta su procesamiento. La mezcla de sangre/guanidina/EDTA se calienta por 15 minutos a ebullición para que las moléculas de ADNk se dividan en piezas de tamaño moderado y de esta manera tener una concentración similar en toda la preparación. Luego, 100ml de esta mezcla se utiliza para la preparación de ADN mediante una extracción con igual volumen de fenol-cloroformo seguida de una extracción con cloroformo, el ADN se precipita con etanol y acetato de sodio. El ADN se deja secar y se reconstituye con 50 ml de agua destilada y se almacena a -20°C hasta su uso.

METODO II
Tomar 200 ml de sangre con EDTA y mezclar con 200 ml de tampón de lisis  (Tris-HCl 10mM (pH 8,0), EDTA 10mM, proteinasa K 1 mg/ml). Incubar a 55°C durante 2 horas. La sangre digerida es tratada dos veces con fenol-cloroformo para extraer el ADN y una vez con cloroformo, el ADN es precipitado con 2,5 volúmenes de etanol 95% y 1/10 de acetato de sodio 3M, se deja secar el ADN y luego se reconstituye con 50 ml de agua destilada para luego almacenarlo a -80°C hasta su  uso.

REACCION EN CADENA DE  LA POLIMERASA (PCR)

METODO I
5 ml de ADN purificado a partir de las muestras de sangre se añaden a un volumen de reacción final  de 100ml que contiene 100 pM de cada uno de los  oligonucleótidos específicos para un fragmento de ADNc de Trypanosoma cruzi  que codifica para una proteína de 24 kDa, T1: 5´-GACGGCAAGAACGCCAAGGAC-3´ que corresponden a los nucleótidos 20 al 26 y T2: 5´-TCACGCGCTCTCCGGCACGTTGTC-3´que corresponden a los nucleótidos 207 a stop. Se añaden Taq ADN polimerasa 2,5U y los dNTPs en concentraciones adecuadas para PCR y se realizan un total de 35 ciclos de desnaturalización (1 min) 94^oC, hibridación (1 min) 60^oC y elongación (2 min) 72^oC. En cada ensayo de PCR se procesan los siguientes controles: