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REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
César Paz y
Miño, Ramiro Burgos, Verónica Dávalos, Mercedes Del
Pozo, Christian Pérez, María E. Sánchez, Paola E.
Leone. Laboratorio de Genética Molecular
y Citogenética Humana, PUCE.
La PCR es una
reacción bioquímica in vitro catalizada por un enzima,
en la cual pequeñas cantidades de un segmento
específico de ADN, que se hallan entre dos regiones de
ADN de secuencia conocida, son amplificadas obteniéndose
una gran cantidad de ADN linear de doble cadena.
Debido a que la PCR está basada en la acción
enzimática de una ADN polimerasa (la más comúnmente
utilizada es la Taq ADN pol I que es una de las enzimas
más extensamente caracterizada y aplicada en biología
molecular), la tecnología de la PCR fue aplicada
inmediatamente en varias áreas de investigación,
incluyendo la tecnología del ADN recombinante, la
expresión génica, medicina general, medicina forense y
evolución. Actualmente, la tecnología de la
PCR ha adquirido mayor importancia con el desarrollo de
las enzimas de restricción, con el clonaje del ADN y con
el Southern blotting en el avance de la biología
molecular. Los primeros experimentos de
amplificación con PCR fueron realizados por Kary Mullis
y el matemático Fred A. Faloonaquien desarrolló el
primer dispositivo automático regulador de la
temperatura en ciclos, conocido como termociclador o
máquina de PCR (Mullis y Faloona, 1987).
La
amplificación del ADN se obtiene por ciclos repetidos de
PCR, cada uno de los cuales tiene tres estadios de
temperatura distintos:
- Desnaturalización
del molde o "plantilla" de ADN (ADN que
servirá de modelo para su amplificación) que
necesita de 94 a 96 grados C.
- Unión o
annealing de los cebadores (primers). Los
cebadores son oligonucleótidos artificiales,
formados por moléculas de cadena simple de ADN
que son complementarios a ambos extremos de una
secuencia determinada de ADN y que actúa como
molde o plantilla. Su función es servir al
molde de ADN como punto de partida para la
polimerización. Este paso requiere una
temperatura que varía entre los 42 a 60
grados C (temperatura que variará en función de
la composición de bases del cebador).
- Extensión
del cebador por ADN polimerasa: Los cebadores son
extendidos en una cadena molde de ADN de simple
cadena (previamente desnaturalizado) gracias al
enzima ADN polimerasa en presencia de
desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs) bajo
condiciones adecuadas de reacción, esto da como
resultado la síntesis de nuevas cadenas de ADN
complementario a las cadenas molde. Para
este paso se requieren temperaturas entre los 60
a 72 grados C. Luego de la extensión
se obtienen moléculas de ADN de doble cadena,
sin embargo, la síntesis de nuevas cadenas de
ADN puede ser repetida volviendo a desnaturalizar
el ADN por calor (desnaturalización),
seguidamente promoviendo la unión de los
cebadores mediante el enfriamiento de la mezcla
para finalmente conducir a la extensión de los
cebadores gracias a la ADN polimerasa a la
temperatura adecuada para cada reacción.
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