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REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)


César Paz y Miño, Ramiro Burgos, Verónica Dávalos, Mercedes Del Pozo, Christian Pérez, María E. Sánchez, Paola E. Leone. Laboratorio de Genética Molecular
y Citogenética Humana, PUCE.

 

La PCR es una reacción bioquímica in vitro catalizada por un enzima, en la cual pequeñas cantidades de un segmento específico de ADN, que se hallan entre dos regiones de ADN de secuencia conocida, son amplificadas obteniéndose una gran cantidad de ADN linear de doble cadena.  Debido a que la PCR está basada en la acción enzimática de una ADN polimerasa (la más comúnmente utilizada es la Taq ADN pol I que es una de las enzimas más extensamente caracterizada y aplicada en biología molecular), la tecnología de la PCR fue aplicada inmediatamente en varias áreas de investigación, incluyendo la tecnología del ADN recombinante, la expresión génica, medicina general, medicina forense y evolución.  Actualmente, la tecnología  de la PCR ha adquirido mayor importancia con el desarrollo de las enzimas de restricción, con el clonaje del ADN y con el Southern blotting en el avance de la biología molecular.  Los primeros experimentos de amplificación con PCR fueron realizados por Kary Mullis y el matemático Fred A. Faloonaquien desarrolló el primer dispositivo automático regulador de la temperatura en ciclos, conocido como termociclador o máquina de PCR (Mullis y Faloona, 1987).

La amplificación del ADN se obtiene por ciclos repetidos de PCR, cada uno de los cuales tiene tres estadios de temperatura distintos:

  1. Desnaturalización del molde o "plantilla" de ADN (ADN que servirá de modelo para su amplificación) que necesita de 94 a 96 grados C.
  2. Unión o annealing de los cebadores (primers).  Los cebadores son oligonucleótidos artificiales, formados por moléculas de cadena simple de ADN que son complementarios a ambos extremos de una secuencia determinada de ADN y que actúa como molde o plantilla.  Su función es servir al molde de ADN como punto de partida para la polimerización.  Este paso requiere una temperatura que varía entre los 42  a 60 grados C (temperatura que variará en función de la composición de bases del cebador).
  3. Extensión del cebador por ADN polimerasa: Los cebadores son extendidos en una cadena molde de ADN de simple cadena (previamente desnaturalizado) gracias al enzima ADN polimerasa en presencia de desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs) bajo condiciones adecuadas de reacción, esto da como resultado la síntesis de nuevas cadenas de ADN complementario a las cadenas molde.  Para este paso se requieren temperaturas entre los 60 a 72 grados C.  Luego de la extensión  se obtienen moléculas de ADN de doble cadena, sin embargo, la síntesis de nuevas cadenas de ADN puede ser repetida volviendo a desnaturalizar el ADN por calor (desnaturalización), seguidamente promoviendo la unión de los cebadores mediante el enfriamiento de la mezcla para finalmente conducir a la extensión de los cebadores gracias a la ADN polimerasa a la temperatura adecuada para cada reacción.

 

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