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  Para la fase de aplicación utilizando camarones reproductores  provenientes de un laboratorio comercial (Playaespec), el protocolo de extracción de ADN escogido se basó en un reactivo denominado DNAzol.  Preliminarmente, la muestra de hemolinfa (aprox. 500 ml) contenida en un microtubo fue centrifugada a 5.000 RPM, durante 6 minutos, eliminando el sobrenadante.  A continuación, el sedimento (células concentradas), se lavó inicialmente con una solución de NaCl 0,9% y luego con una solución fría (Tris HCl 20mM y EDTA 10 mM) centrifugándose después de cada lavado a la velocidad y tiempo señalados anteriormente.  Se añadió 1 ml de DNAzol (Gibco, BRL) al sedimento, revolviéndolo con la pipeta, procediendo a centrifugar durante 10 minutos a 10.000 RPM  y recuperando el contenido en otro microtubo.  Se adicionó 500 ml de etanol al 100% y se agitó manualmente hasta que se produjo la precipitación del ADN.  Se centrifugó a 4.000 RPM por 2 minutos, se eliminó el sobrenadante y se lavó varias veces con etanol 95%.  Finalmente, el ADN fue secado y resuspendido en agua destilada.

AP-PCR
Se probaron varios protocolos de AP-PCR, entre ellos, los publicados por García y cols., 1994 ; y Tassanakajon y cols., 1997. De igual modo, los cebadores (decámeros) utilizados procedieron de estos trabajos.
El protocolo utilizado para la fase de aplicación fue realizado empleando un termociclador Ericomp programado para 40 ciclos.  Las condiciones para cada ciclo fueron las siguientes : 94
°C por 5 segundos, 36°C por 45 segundos y 72°C por 1,5 minutos.  Empleamos alrededor de 50 ng de ADN en un volumen de 50 ml de reacción, conteniendo tampón 1X (Promega), dNTPs 0,2 mM (Promega), MgCl2 2 mM (Promega), 1 mg de cebador (Gibco, BRL), Taq polimerasa 1U (Promega) y agua destilada hasta completar el volumen.
Las muestras fueron depositadas en un gel de TAE y agarosa (Gibco, BRL) al 1,8 % y la electroforesis fue realizada a 70 V durante 3 horas utilizando 0,5
mg de un marcador de peso molecular de 1 Kb (Promega).  Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (SIGMA) y  fotografiados.

RESULTADOS Y DISCUSION
Implantación
Los experimentos de AP-PCR fueron emprendidos considerando inicialmente los parámetros publicados por García y cols., 1994.  En estas condiciones no se obtuvo ningún producto de amplificación.
Sin embargo, en una serie posterior de experimentaciones se pudo establecer que cantidades relativamente importantes de ADN de camarón (más de 200 ng) ocasionaba ausencia de amplificaciones. Por ello, para las experimentaciones posteriores se consideró utilizar ADN de camarón en cantidades menores a 100 ng por muestra.
El desarrollo de un protocolo de AP-PCR modificado contribuyó al avance de las experimentaciones restantes.
El tejido sanguíneo (hemolinfa) fue escogido como el más apropiado para extraer el ADN,  por  la  necesidad  de  mantener vivo  al  organism o  estudiado.  Así,  la

 

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