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amplificada
también es desconocida. Para que exista amplificación de
un fragmento RAPDs en el genoma analizado, dos secuencias
de ADN complementarias al cebador arbitrario deben estar
suficientemente adyacentes (<4.000
pares de bases) y en orientación opuesta, de manera que
exista una amplificación exponencial de un segmento de
ADN por la ADN polimerasa. En función de las grandes
cantidades de ADN producidos, este segmento puede ser
visualizado directamente en forma de una banda en un gel
de electroforesis. La electroforesis generalmente se
realiza en geles de agarosa y son visualizados con
bromuro de etidio bajo luz ultravioleta.
Alternativamente, geles de poliacrilamida, de alta
resolución pueden ser utilizados y las bandas
visualizadas por autoradiografía (AP-PCR) o teñidos con
nitrato de plata. Típicamente cada cebador arbitrario
utilizado dirige una síntesis de varios segmentos de ADN
simultáneamente en diversos puntos del genoma,
resultando así varias bandas en el gel.
NATURALEZA MOLECULAR DEL LOCUS RAPDs
La naturaleza molecular del polimorfismo RAPDs no está
enteramente conocida. Hasta tanto, evidencias
experimentales, indican que diferencias de apenas un par
de bases (mutaciones puntuales) son suficientes para
causar no complementariedad del cebador con el sitio de
iniciación ("priming site") y así impedir la
amplificación de un segmento (Williams y cols., 1990).
Otras fuentes de polimorfismo pueden incluir deleciones
de sitios de iniciación o inserciones que colocan dos
sitios de iniciación adyacentes a una distancia mayor a
la que la ADN polimerasa es capaz de actuar.
DOMINANCIA DE MARCADORES RAPDs
Una característica fundamental de los marcadores RAPDs,
es que se comportan como marcadores genéticos
dominantes. Dominancia en esta caso se refiere al
concepto clásico de interacción génica entre alelos de
un mismo locus; al observar una banda RAPDs en un gel, no
es posible distinguir si aquel segmento se originó a
partir de una o dos copias de secuencia amplificada. O
sea, un individuo diploide homocigoto para aquel locus
RAPDs posee dos alelos RAPDs idénticos (AA) a partir de
los cuales la amplificación ocurre; por otro lado un
individuo heterocigoto (Aa) para un mismo locus RAPDs
posee un alelo (A) que es amplificado y otro (a) que no
lo es, debido a cualquier caso de polimorfismo
mencionadas. La detección de segmentos RAPDs no tiene
sensibilidad cuantitativa para discriminar en los dos
casos; por esto, en cuanto al genotipo homocigoto
"recesivo" (aa) es identificado por la ausencia
de banda en el gel (fenotipo nulo), y los genotipos
homocigotos "dominantes" (AA) y heterocigoto
(Aa) son colocados juntos n una misma clase fenotípica,
esto es la presencia de la banda en el gel. La técnica
de RAPDs detecta, así mismo apenas un alelo en cada
locus. La ausencia de banda representa, en verdad, el
conjunto de todos los otros alelos de aquel locus que no
pueden ser amplificados por un motivo u otro (mutaciones,
inserciones, deleciones, etc.)
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