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PRINS: APLICACIÓN DE LA PCR EN FISH


Paola E. Leone, César Paz y Miño.  Laboratorio de Genética Molecular y Citogenética Humana, PUCE.

El marcaje in situ mediante cebadores (PRINS: PRimed IN Situ labeling) es un método más rápido, alternativo a la hibridación in situ fluorescente (FISH), en el que se aplicará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

PRINS consiste en una reacción en cadena de la polimerasa realizada en el portaobjetos con las células fijadas utilizando un cebador que se unirá al ADN cromosómico y se elongará in situ incorporando oligonucleótidos marcados. Para lo cual se emplea una solución con los cebadores para la secuencia a localizarse y los reactivos de la PCR con un nucleótido marcado con biotina o con digoxigenina (las que reaccionan específicamente, biotina reacciona con avidina y la digoxigenina con su anticuerpo antidigoxigenina; estas sustancias pueden ser acopladas a una sustancia fluorescente, fluoresceína, rodamina) con lo que se logra la hibridación molecular de la secuencia del ADN amplificado con el nucleótido marcado y la sonda marcada para determinada secuencia, que permitirá su detección mediante la señal fluorescente. Se coloca la solución sobre el portaobjetos y éste en un termociclador para efectuar la síntesis in situ, utilizando como molde de ADN, el material fijado (cromosomas metafásicos o núcleos interfásicos).

PRINS implica los siguientes pasos:

1) Extensión de la preparación cromosómica en el portaobjetos bajo condiciones estándar.

2) Desnaturalización de los cromosomas fijados, a 94°C.
3) Unión de los oligonucleótidos cebadores PRINS específicos de cada cromosoma a una temperatura óptima de hibridación y elongación entre 60-68°C.
4) Elongación del cebador con Taq ADN polimerasa y una mezcla especial de nucleótidos que contiene digoxigenina-11-dUTP.
5) Detección de la digoxigenina incorporada, marcando con un conjugado del anticuerpo antidoxigenina - fluoresceína.
6) Observación de los cromosomas marcados en un microscopio fluorescente.

La utilización de PRINS presenta algunas ventajas frente a la tradicional FISH:

1) Menor inespecificidad: La marcación ocurrirá después de la hibridación específica, con lo que habrá poca tinción de fondo en zonas que no nos interesan.
2) Rapidez: La desnaturalización toma 3-4 minutos, la hibridación y elongación de la cadena (en una reacción) normalmente toma unos 30 minutos. El proceso completo, incluyendo la detección fluorescente toma 2 horas.
3) Sensibilidad: Con la aplicación de Cycling PRINS (In Situ cyclic amplification of oligonucleotide primed synthesis) se puede detectar ADN de pocas copias o secuencia única.

Se comparan resultados de PRINS con cycling PRINS de 5, 10 y 20 ciclos.

 

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