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HIBRIDACION IN SITU FLUORESCENTE - FISH


César Paz y Miño, Thomás Morán, Ramiro Burgos, Ma. Verónica Dávalos, Mercedes Del Pozo, Christian Pérez, María E. Sánchez, Paola E. Leone. Laboratorio de Genética Molecular y Citogenética Humana, PUCE.


La hibridación in situ fluorescente, se la puede incluir dentro de las técnicas denominadas citogenética molecular, esto significa, que mezcla la citogenética clásica con sus preparaciones cromosómicas estándares y las técnicas de genética molecular como son la preparación de sondas artificiales de nucleótidos con capacidad de unirse a sus complementarias de ADN problema.

La técnica FISH, la cual pertenece a un tipo de Hibridación In Situ no isotópica, es una poderosa herramienta que nos permite analizar la complejidad y la organización estructural de los genomas.  Basados en el hecho de que este tipo de técnica no usa isótopos radioactivos para la visualización de las secuencias genómicas, se puede decir que la complejidad de los procesos y sus riesgos son menores; pero también es cierto que su práctica es muy costosa, no sólo en la preparación de los híbridos, sino también en los equipos requeridos para su observación.

La metodología usada en la producción de los híbridos es muy variada, y va a depender del análisis que se desea; pero todos utilizan un mismo fundamento.  Lo que se hace es producir secuencias de ADN específicas, de una sola cadena (utilizando metodologías de ADN copia) en donde ciertas bases orgánicas han sido reemplazadas por ácidos nucléicos marcados no isotópicamente, bases manipuladas o substancias que reemplazan a las bases, y que luego pueden ser reconocidas por anticuerpos, que son incorporados a la cadena por procesos de incorporación enzimática.  Para la modificación de los nucleótidos las substancias más usadas suelen ser: biotina, digoxigenina, dinitrofenol o nucleótidos halogenados.  Para muchos de los análisis, especialmente de genes, las secuencias se pueden encontrar en el mercado en forma de sets de sondas; es importante anotar que en el caso de las secuencias de ADN estas se pueden amplificar por PCR manteniendo así parte del set sin tener que renovarlo constantemente, y esto reduce en grn parte el costo de la técnica.

Luego de que la secuencia deseada se ha formado, ésta es hibridada con el ADN, que se quiere analizar, in situ.  Estas muestras son luego expuestas a anticuerpos que contienen tintes fluorescentes y luego de procesos de lavado son observados en microscopios epifluorescentes; o en el caso de los que contenían nucleótidos halogenados que presentan fluorescencia de por sí, estos son observados directamente al microscopio.
El análisis de los portaobjetos es muy sencillo ya que solamente se requiere observar las señales emitidas por los híbridos.  Estas señales son visualizadas en forma de manchas de color fluorescente y que nos muestran que el híbrido se ha formado y, que por lo tanto, la secuencia genómica  que buscamos sí se encuentra en el ADN analizado.
Además  la  FISH  se  puede  usar  no  sólo  para  el  análisis  de  una  sola

 

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