HIBRIDACION IN SITU
FLUORESCENTE - FISH
La hibridación in situ fluorescente, se la puede incluir dentro de las técnicas denominadas citogenética molecular, esto significa, que mezcla la citogenética clásica con sus preparaciones cromosómicas estándares y las técnicas de genética molecular como son la preparación de sondas artificiales de nucleótidos con capacidad de unirse a sus complementarias de ADN problema. La técnica FISH, la cual pertenece a un tipo de Hibridación In Situ no isotópica, es una poderosa herramienta que nos permite analizar la complejidad y la organización estructural de los genomas. Basados en el hecho de que este tipo de técnica no usa isótopos radioactivos para la visualización de las secuencias genómicas, se puede decir que la complejidad de los procesos y sus riesgos son menores; pero también es cierto que su práctica es muy costosa, no sólo en la preparación de los híbridos, sino también en los equipos requeridos para su observación. La metodología usada en la producción de los híbridos es muy variada, y va a depender del análisis que se desea; pero todos utilizan un mismo fundamento. Lo que se hace es producir secuencias de ADN específicas, de una sola cadena (utilizando metodologías de ADN copia) en donde ciertas bases orgánicas han sido reemplazadas por ácidos nucléicos marcados no isotópicamente, bases manipuladas o substancias que reemplazan a las bases, y que luego pueden ser reconocidas por anticuerpos, que son incorporados a la cadena por procesos de incorporación enzimática. Para la modificación de los nucleótidos las substancias más usadas suelen ser: biotina, digoxigenina, dinitrofenol o nucleótidos halogenados. Para muchos de los análisis, especialmente de genes, las secuencias se pueden encontrar en el mercado en forma de sets de sondas; es importante anotar que en el caso de las secuencias de ADN estas se pueden amplificar por PCR manteniendo así parte del set sin tener que renovarlo constantemente, y esto reduce en grn parte el costo de la técnica. Luego de que la
secuencia deseada se ha formado, ésta es hibridada con
el ADN, que se quiere analizar, in situ.
Estas muestras son luego expuestas a anticuerpos que
contienen tintes fluorescentes y luego de procesos de
lavado son observados en microscopios epifluorescentes; o
en el caso de los que contenían nucleótidos halogenados
que presentan fluorescencia de por sí, estos son
observados directamente al microscopio.
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