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  La reacción continúa y las cadenas seguirán creciendo siempre con una base defectiva extra. Para el ejemplo la base defectiva esta señalada con un asterisco.

La reacción típica empleada en el laboratorio consiste en una desnaturalización, 2 minutos a 94°C, luego se continúa con 45 a 60 ciclos de tres temperaturas: desnaturalización a 94°C, hibridación de los cebadores a 42°C y extensión  a 70°C.

Una vez completado el programa del termociclador se agrega 3 ml de la solución de parada de secuenciación a cada reacción.

GEL DE POLIACRILAMIDA PARA SECUENCIACION

Los fragmentos resultantes de la reacción se separan entonces mediante desnaturalización y se fraccionan en un gel desnaturalizante de mezcla (19:1) al 40% de acrilamida: N,N'-metilenbisacrilamida. Tras la detección fluorescente, quimioluminiscente, tinción con plata o autoradiografía se produce un característico patrón en escalera, en el que puede leerse la secuencia. En el laboratorio teñimos los geles con plata.

Según el tamaño del exón a analizar, se corre en gel de poliacrilamida de 3 a 8 horas a 50 W a temperatura ambiente. Es importante mantener fríos los cristales y esto se puede lograr con un ventilador incorporado a la bandeja de secuenciación.

SECUENCIACION AUTOMATICA

Se sigue el protocolo de Perkin Elmer (P/N 402116) (ABI PRISM-Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit) para un secuenciador de ADN ABI 373. Para ello se emplean 60 ng del producto de PCR purificado sucesivamente por electroelución y los microconcentradores centriconâ, de acuerdo al protocolo de Amiconâ.

Para conocer la secuencia de ADN, el ABIPRISMä 373 traduce los datos de la electroforesis para ser visualizados como un electroferograma.

Al igual que la SSCP, tanto en la secuenciación manual como en la automática, los cristales y la carga del gel con las muestras es similar.

CONCLUSION

Las primeras experiencias de secuenciación en el laboratorio, fueron secuenciando exones del gen oncosupresor NF2 que nos han demostrado la factibilidad de descifrar el código de la herencia en un país cuya actividad científica es complicada. Hasta donde hemos podido conocer es la primera vez que se secuencia genes en nuestro medio y lo estamos haciendo con relativo buen éxito.

La secuenciación no radioactiva es una técnica segura, no contaminante y protege a los investigadores; otras formas de trabajo en las cuales se introduzca radioactividad, nos parecen peligrosas y una falta de respeto a los principios de bioseguridad y bioética, ya que demandarían áreas de trabajo determinadas y restringidas, control de calidad, control de desechos radioactivos, biomonitorización, biodosimetría de exposición, control de ambientes compartidos, trajes, etc. que no tenemos en nuestra universidad y que por lo mismo podrían ser el inicio aun de acciones legales de los afectados.

 

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