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POLIMORFISMO EN LA CONFORMACION DE LA CADENA SENCILLA BASADO EN LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR-SSCP) - ANALISIS DE HETERODUPLEX


Paola E. Leone, Mercedes Del Pozo, César Paz y Miño. Laboratorio de Genética Molecular y Citogenética  Humana, PUCE.

En la investigación biomédica es importante la detección eficiente y segura de mutaciones del material genético, para lo cual se ha desarrollado una variedad de métodos resultando la técnica de SSCP, Polimorfismo en la Conformación de la Cadena Sencilla de ADN, la más simple, rápida y versátil. La SSCP es un método de electroforesis que permite detectar, pero no caracterizar, mutaciones y polimorfismos. El producto génico amplificado por la técnica de PCR = reacción en cadena de la polimerasa (PCR = polymerase chain reaction) es separado por calor en sus dos cadenas sencillas y puesto a correr en un gel de acrilamida:bis-acrilamida no desnaturalizante. Basado en el principio de que la movilidad electroforética, de una molécula en un gel, es sensible al tamaño, carga y forma de la molécula. En un gel no desnaturalizante, las dos cadenas sencillas de ADN desnaturalizado, a medida que migran electroforéticamente, adquieren una conformación tridimensional, según la secuencia nucleotídica que constituye a cada un. En el análisis de SSCP, el cambio de un solo nucleótido es suficiente para alterar la estructura tridimensional de una secuencia con respecto a otra. Esta alteración del ADN se detecta como una migración diferente de una o ambas cadenas en la electroforesis del gel, dependientes de la conformación adoptada por cada cadena sencilla. La capacidad de la PCR-SSCP para detectar mutaciones depende de cómo la mutación afecta al plegamiento de la molécula y cómo el plegamiento afecta a la movilidad electroforética.

El patrón de bandas obtenido en una muestra problema se compara con una serie de patrones de referencia, conocidos en su secuencia de bases nitrogenadas. Si el patrón de bandas obtenido en la muestra problema coincide con alguno de los patrones de referencia, es posible concluir que la secuencia de dicha muestra es probablemente la misma que la del patrón con el que coincide. Si, por el contrario, el patrón obtenido con dicha muestra  es distinto al obtenido en los patrones de referencia, entonces es posible concluir que la muestra problema presenta un cambio en su secuencia. Para determinar de qué cambio se trata hay que secuenciar la muestra problema de ADN.
La SSCP detecta del 70% a 95% de mutaciones en los productos de PCR de 200 pb y de menor tamaño. Presenta el inconveniente de que no detecta la totalidad de las posibles variantes de secuencia. En 1989, Orita y colaboradores son los primeros en informar de la técnica de SSCP para detectar mutaciones, desde entonces con el fin de identificar cambios mínimos como sustituciones de un

 

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