TECNICA DE RETROTRASCRIPCION Y REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (RT-PCR)

César Paz y Miño, Mercedes Del Pozo, Ramiro Burgos, Paola E. Leone. Laboratorio de Genética Molecular y Citogenética Humana, PUCE.

Todos los volúmenes y concentraciones de la reacciones, así como los primeras utilizados constan en el artículo: Thompson J D., Brodsky I., Yunis J. (1992) Molecular Quantification of Residual Disease in Chronic Myelogenous Leukemia After Bone Marrow Transplantation. Blood 79(6): 1629-1635.

Procedimiento:

Tomar un tubo de 0,5 ml, rotularlo con el número de la mesa que corresponde y una A:

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Reactivos      Concentración final    Volumen para 1 tubo
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- buffer Taq (5X)  2X    4    ml
- dNTPS:  A(5mM)  0,5  mM  1    ml
                T(5mM)  0,5  mM  1    ml
                  C(5mM)  0,5  mM  1    ml
                  G(5mM)            0,5  mM  1    ml 
- cebador 2C(24,5uM) 2,5  mM  1    ml
- H₂0 dEPC estéril      3    ml
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      Vf:    12  ml

- En el mismo tubo de  (0,5 ml)  añadimos:    __________________________________
  12 ml  RT-PCR Mix
    7 ml  ARN
    1 ml  Reverso Taq
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Vf:    20  ml  + ~ 60 ml de aceite mineral
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Condiciones del termociclador:
60 minutos a 42 °C    FILE 34